前文讲述了蛋白质偶联反应的机理，本文对蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与小分子间的偶联方法进行了详细阐述。
蛋白质-蛋白质偶联方法
?蛋白质-蛋白质偶联在免疫检测中通常用于酶标记抗体或抗原，即制备信号标记物。蛋白质-蛋白质偶联方法主要包括高碘酸盐法（直接连接法）、双马来酰亚胺法（同双功能偶联法）、巯基-马来酰亚胺法（异双功能偶联法）。
1.高碘酸盐法
高碘酸盐法为一种直接偶联方法，主要用于目标蛋白质中至少含有1个糖蛋白的情况。高碘酸盐氧化糖基，使邻二醇的碳形成两个醛基，这些醛基与另一蛋白质的氨基形成席夫碱反应而交联，进一步可使用硼氢化钠对上述反应产物进行还原处理形成更加稳定的仲胺（-NH-）结构。该方法主要用于制备HRP偶联物以及对IgG的Fc端进行标记。
图1高碘酸盐法偶联蛋白质
2.双马来酰亚胺法
双马来酰亚胺法是用含有两个马来酰亚胺基团的同双功能试剂对巯基进行连接，当两种目标蛋白质中均有少量巯基时，可以采用该方法，含有双巯基反应性的N,N’-（邻亚苯基）二马来酰亚胺（PDM）应用最为广泛。该方法可有效避免戊二醛与蛋白质氨基交联形成聚集体或交叉偶联的现象。在免疫检测中该方法特别适用于将β-半乳糖苷酶与抗体片段如Fab或Fab’偶联。
图2双马来酰亚胺法偶联蛋白质
3.巯基-马来酰亚胺法
巯基-马来酰亚胺法为异双功能偶联方法，能够更好地控制产物的构成。该方法通常需要两种试剂，一种试剂包含氨基反应基团并携带巯基，另一种试剂包含氨基反应基团并携带马来酰亚胺。游离巯基通常自发形成不需要的二聚体，在实际应用中巯基以被保护的形态存在，如S-乙酰化合物。
图3巯基-马来酰亚胺法偶联蛋白质
在蛋白质-蛋白质偶联方法中，基于巯基和马来酰亚胺反应的异双功能偶联的方法占据着主导地位。马来酰亚胺也可以被其他反应基团所代替而与巯基偶联，如含有二硫键的化合物SPDP。
蛋白质-小分子偶联方法
蛋白质-小分子的偶联在免疫检测中有两个重要的应用场景。一是用于生物素标记酶或抗体，以便于通过生物素和链霉亲和素的桥连作用进一步实现两个蛋白质分子间的偶联，避免或减小对蛋白质分子构象的改变。二是用于荧光素或发光基团标记抗体或抗原，生成信号标记物。蛋白质-小分子的偶联方法通常基于羧基与氨基的反应，除此之外，曼尼希反应或商品化的即用型偶联试剂提供了较好的备选方案。蛋白质-小分子偶联方法主要包括碳二亚胺法、碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺酯法、混合酸酐法、曼尼希反应和利用商品化的即用型偶联试剂进行偶联。1.碳二亚胺法和碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺酯法
碳二亚胺可以活化羧基产生O-酰基异脲中间体，该中间体与蛋白质的氨基发生反应偶联。碳二亚胺化合物分为水溶性和非水溶性两类，二环己基碳二亚胺（DCC）是最常见的非水溶性碳二亚胺化合物，而常用的水溶性碳二亚胺化合物是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDAC）。使用DCC典型的偶联反应分两步：首先在与水互溶的有机溶剂中引入DCC对小分子进行衍生，然后再将上述产物加入到蛋白质水溶液中实现偶联。选择EDAC进行羧基活化时，活化和偶联可以一步进行，但其缺点是异脲形成的最佳pH是5~6，远低于氨基的最佳活性范围（9~10）。因此即使选择EDAC进行羧基活化，偶联反应仍倾向于分步进行以提高产率。
碳二亚胺偶联法中产生的中间体异脲常在原位被转化为琥珀酰亚胺酯，后者再与蛋白质的氨基进行反应偶联，该方法可有效提高产率。常选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和DCC的混合物在有机溶剂中活化羧基，而后将其加入蛋白质水溶液中。水溶性的N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHSS）可以用在EDAC的一步法中。就结合效率而言，两步DCC/NHS合成方法产率高，是含羧基化合物与蛋白质偶联的最佳选择。纯水相环境可以避免有机试剂对蛋白质的影响，但其产率受水解作用的影响。
图4碳二亚胺法和碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺法偶联蛋白质与小分子
2.混合酸酐法
酸酐是两个羧基脱水后形成的化合物，其能够在水溶液中长期稳定存在并与蛋白质上的氨基反应。实际应用中常在无水环境下采用氯甲酸酯与小分子形成混合酸酐中间体，而后与蛋白质在水相中偶联，氯甲酸异丁酯是最常用的氯甲酸酯。
图5混合酸酐法偶联蛋白质与小分子
3.曼尼希反应
曼尼希反应的速率和产率通常较低，但当常规难以实现偶联时，可以作为一种替代方法。在曼尼希反应中，蛋白质上的氨基在醛（常为甲醛）的存在下能够与多种有机物上的碳原子进行偶联，碳原子需要包含一个活泼而易脱去的氢原子。
图6曼尼希反应偶联蛋白质与小分子
4.即用型偶联试剂
随着蛋白质修饰和抗体偶联市场需求的不断增加，很多即用型的偶联试剂可以通过商业渠道获得。生物素琥珀酰亚胺酯（biotin-NHS）是比较常用的商品化生物素偶联试剂，可以与蛋白质的氨基进行偶联。以琥珀酰亚胺酯和异硫氰酸酯形式存在的荧光或发光基团衍生化偶联试剂也可以通过商业渠道获得。这种即用型的试剂为蛋白质的偶联提供了便捷、有效的方法，产率高，同时可以有效保留蛋白质的活性。
通过以上方法获得蛋白质-蛋白质偶联物、蛋白质-小分子偶联物通常是混合物，包括目标产物以及未反应的蛋白质或小分子单体。在实际使用过程中，需要对获得的混合物进一步纯化以及对目标产物进行表征，具体的纯化和表征方法在文章中进行详细阐述。
参考文献：大卫·韦德，《免疫检测原理与应用》，人民出版社。
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本文编辑：佚名
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